Still Struggling with Protein Instability? A Guide to Prolonging the Lifespan of Your Proteins

Proteins are delicate biomolecules whose stability is crucial for successful experiments. Understanding the causes of instability and implementing proper handling techniques can significantly extend their functional life.

I. Common Causes of Protein Inactivation
1.Dilution: Over dilution leads to low protein concentration, causing excessive dispersion and instability in solution. We generally recommend reconstituting recombinant proteins at concentrations greater than 0.1 mg/ml. However, standard in ELISA kits are often at very low concentrations and thus inherently unstable after dissolution.
2.Altered Solution Conditions: Protein products are typically stabilized in an optimized buffer during production. Lyophilized proteins come with recommended reconstitution buffers. Changing this buffer, especially to uncommon solutions or unsuitable pH levels, can rapidly lead to inactivation or aggregation.
3.Exposure to Degrading Agents: Exposure to degradative enzymes, oxygen, heavy metals, or certain material surfaces can degrade proteins. Protein products are usually stored in polypropylene tubes with screw caps to minimize such exposure.
4.Physical Stress: The most common and impactful stresses are freeze-thaw cycles and inappropriate temperatures.
 

II. Standard Handling Practices and Precautions
1.Avoid vigorous stirring, vortexing, or pipetting of protein solutions, as these actions create bubbles leading to oxidation and surface denaturation.
2.Do not expose proteins to extreme pH, high temperatures, organic solvents, or other denaturing conditions.
3.Liquid storage solutions must be sterile to prevent bacterial or fungal growth.
4.Lyophilized (freeze dried) powder generally significantly enhances protein stability, and the lyophilization matrix often contains protective agents. If liquid storage is necessary, adding an appropriate concentration of glycerol can prevent solidification.
 

III. How to Choose Concentration and Solvent Conditions
1.Concentrate proteins to >0.1 mg/ml, ideally >1 mg/ml.
2.Determine the protein's isoelectric point (pI) and maintain a solution pH that differs from the pI by at least 1 unit.
3.Use moderate ionic strength. Be cautious with anions, as Clcan sometimes be detrimental. EDTA is often added as a protective agent at a concentration of around 0.1 mM.
4.Maintain a reducing environment to prevent oxidation, particularly of Cys residues. DTT (0.1-1 mM) is preferred over β-mercaptoethanol.
5.Glycerol (5%-20%) helps maintain stability and is compatible with most purification steps.
6.Occasionally, adding low concentrations of non-ionic detergents can prevent protein aggregation or adsorption to surfaces.
7.Incorporate protease inhibitors during protein preparation.
 

IV. Assessing Activity Loss and Major Loss Points in Purification
The best method to assess activity loss is to calculate specific enzyme activity. A 50% loss of activity during purification is common. Affinity purification often has a greater impact on activity compared to gel filtration. Major reasons for significant activity loss include:
Tight Binding to Resin: Incomplete elution due to tight binding. More stringent elution conditions, increased ionic strength, chaotropic salts (e.g., KBr), or adding detergents/ethylene glycol to the elution buffer can improve recovery.
Cofactor Requirements: Some proteins require specific cofactors or ligands for activity which may be lost during purification.
Surface Adsorption: Low  concentration proteins can adsorb to container surfaces. Avoid polystyrene; use compatible buffers for rinsing, or add low concentrations of non  ionic detergents to prevent non-specific adsorption.
Common Protease Inhibitors:
During initial purification steps (crude extract), protease levels are highest. Common inhibitors include:
 • PMSF: Serine protease inhibitor.
• EDTA/EGTA: Metalloprotease inhibitors.
• Leupeptin: Inhibits thiol proteases.
• Aprotinin: Serine protease inhibitor.
• Antipain: Thiol protease inhibitor.
• Pepstatin A: Aspartic protease inhibitor.
• Benzamidine: Serine protease inhibitor.
 

V. Practical Strategies for Maximizing Protein Activity
50% Glycerol: This is a highly effective and common stabilizer for storage at -20°C. However, high glycerol can interfere with downstream applications. If necessary, it can be removed via dialysis or ultrafiltration, though these steps may cause some protein loss.
Add Stabilizers: Adding stabilizing matrices or inert proteins like BSA can protect the target protein.
Avoid Freeze-Thaw Cycles: Maintain non-frozen conditions (e.g., at 4°C for short term), aliquot into single  use portions, or use rapid freezing/thawing methods to minimize damage.
 

In summary, proteins are inherently fragile and sensitive molecules. Their stability varies greatly depending on their sequence and structure. The most reliable approach upon receiving a protein product is to follow the manufacturer's instructions for handling and complete experiments promptly.

ELK Offers High-Quality Protein Research Solutions
For reliable protein analysis, trust ELK's range of products, including sensitive ELISA kits and specialized reagents designed to ensure accurate and reproducible results in your research.